2015藥典 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物限度檢查 微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準時，應(yīng)按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

微生物計數(shù)試驗應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于 B 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢驗全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進行監(jiān)測。

如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認其對微生物無毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。

計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微 生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。

供試品檢查時, 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù) 方法，所選的方法必須具備檢測充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗結(jié)果能 夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認。

菌種及菌液制備

試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌 種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué) 特性。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表 1。

菌液制備 按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管 內(nèi)，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小時內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使 用。

二、陰性對照

為確認試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行陰性對照試驗， 陰性對照試驗應(yīng)無 菌生長。如陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。

培養(yǎng)基適用性檢查 微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。

按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表 1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。

每一試驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培 養(yǎng)基進行上述試驗。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在 0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基 管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。

供試液制備 

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液

制備若需加溫時,應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過 45℃。供試液從制備至加入檢驗 用培養(yǎng)基,不得超過 1 小時。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應(yīng) 建立其他適宜的方法。

⑴ 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

⑵ 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩 沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。 分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將 供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⑶油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少 量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80 或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分 混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40℃（特殊情況下，最多不超過 45℃）， 小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成 1∶10 供試液， 保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性 劑的稀釋液進一步 10 倍系列稀釋。

⑷需用特殊方法制備供試液的供試品

⒉ 接種和稀釋
按下列要求進行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的 1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。

（1） 試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供試品對照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

（3）菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試 液進行方法適用性試驗時，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果 供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋 或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適應(yīng)性試驗。

⒊ 抗菌活性的去除或滅活

供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù)值的 50%，可采用下 述方法消除供試品的抑菌活性。

⑴增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。

⑵加入適宜的中和劑或滅活劑。

⑶采用薄膜過濾法。

⑷上述幾種方法的聯(lián)合使用。 若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有抗菌活性，同時也表明供試品不可能被該類微生物污染。但 是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。 因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果 判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用 性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供 試液進行供試品檢查。

⒋ 供試品中微生物的回收

⑴ 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至 少制備 2 個平皿，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。

傾注法 取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅 活”制備的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中, 注入 15～20ml 溫度不超過 45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。 同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取 15～20ml 溫度不超過 45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基，注入直徑 90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng) 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面 接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備的供 試液不少于 0.1ml。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液 對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

⑵ 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45μm,直徑一 般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。
選擇濾膜材質(zhì)時 應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適 宜的方法滅菌。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前 先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分 干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾 膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一 般為 100ml?？倹_洗量不得超過 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備 的供試液適量（一般取相當(dāng)于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌 數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖 洗液沖洗濾膜。

若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上； 若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。

按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

⑶ MPN 法 MPN 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在 供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。若 使用 MPN 法，按下列步驟進行。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的去除或滅活”制備 的供試液至少 3 個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9～ 10ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)基 中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管置 30～35℃培養(yǎng) 3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供 試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng) 1～2 天，觀察是否有微生物生長。 根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表 3 查對被測供試品每 1g 或每 1ml 中需氧菌總數(shù)的最 可能數(shù)。

⒌ 結(jié)果判斷

計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法或時，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5～2 范圍內(nèi)；采用 MPN 法，試驗組菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)的 95%置信限內(nèi)。若各試驗菌的回收試 驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總 數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不 到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。